靶向不成成药靶点KRAS[1]
KRAS简介- RAS是GTPase原癌基因家族成员 ，蕴含三个亲昵有关的RAS亚型：HRAS、KRAS和NRAS。在所有RAS亚型中 ，KRAS突变频率最高 ，其次是NRAS和HRAS。KRAS突变在胰腺癌、肺癌和结直肠癌中尤为常见。在癌症中最常产生突变的残基是G12、G13和Q61。KRAS蛋白存在两种剪接变体KRAS4A和KRAS4B ，其中KRAS4B在人类细胞中占主导职位。KRAS(Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog ，Kirsten大鼠赘瘤病毒癌基因同源物)基因是一种编码GTP/GDP结合蛋白的原癌基因 ，属于GTPase RAS家族。KRAS蛋白作为分子开关 ，在GDP结合的无活性状态和GTP结合的活性状态之间循环。KRAS蛋白别离通过与GTP和GDP结合 ，在无活性大局和活性大局之间转换。固然KRAS蛋白拥有内涵的核苷酸互换和GTP水解能力 ，但其细胞信号传导状态是由鸟嘌呤核苷酸互换因子(GEFs)激活引起的 ，如催化GTP结合的SOS(Son of Sevenless)和Ras鸟嘌呤核苷酸开释蛋白 ，以及GTPase激活蛋白(GAPs)催化的去激活作用 ，如刺激GTP水解的p120GAP和神经纤维蛋白(NF1)。
KRAS GTPase循环[1]
KRAS结构- KRAS蛋白蕴含四个结构域。在三种RAS亚型中 ，N端的第一个结构域是一样的 ，第二个结构域的序列类似性相对较低。这两个区域对KRAS蛋白的信号职能都很沉要 ，并共同形成了G-结构域。KRAS蛋白分子量为21 kDa ，由6条β-折叠链(形成蛋白主题)和5条α螺旋结构组成 ，形成两个重要结构域：G结构域和C端结构域。KRAS的G结构域由残基1-166组成 ，蕴含GTP结合口袋 ，该区域对于下游效应物和GTPase激活蛋白(GAPs)之间的相互作用至关沉要。G结构域是高度守旧的 ，蕴含掌管GDP-GTP互换的switch I和switch II区域。C端是一个蕴含CAAX (C=半胱氨酸 ，A=肆意脂肪氨基酸 ，X=肆意氨基酸)基序的高变区 ，疏导翻译后建饰并决定细胞膜锚定。该区域在RAS蛋白的生物活性调控中起着沉要作用。
KRAS的晶体结构[2]
KRAS二级结构的二维示意图[2]
KRAS信号通路- KRAS是激活一系列信号分子的上游信号传感器之一 ，可能转导信号从细胞表表传递到细胞核 ，并调控一系列根基的细胞过程 ，如细胞分化、成长、趋化和凋亡。除了上述GTP/GDP结合表 ，KRAS信号的激活此刻被以为是一个多步骤的过程 ，必要适当的KRAS翻译后建饰、细胞膜定位和与效应蛋白的相互作用。KRAS蛋白的信号转导并不只产生在细胞膜上。KRAS对下游信号通路的激活也能够由亚细胞区域(如内质网和高尔基体)的信号触发。在细胞表刺激作用下 ，从失活的RAS-GDP到激活的RAS-GTP的转化进一步推进了多种信号通路的激活 ，蕴含MAPK通路、PI3K通路和Ral-GEFs通路 ，其中以MAPK通路的特点最为显著。已知RAS-GTP直接与RAF蛋白结合 ，将RAF激酶家族从细胞质招募到膜上 ，在细胞膜上二聚化并活化。激活的RAF随后对其下游底物 ，即MEK和ERK进行一系列磷酸化反映 ，并传导成长信号。
重要的KRAS效应通路[1]
KRAS蛋白的结晶钻研- 高通量结晶筛选1000+筛选前提
- 上海同步辐射光源 (Shanghai Synchrotron Radiation Facility; SSRF)J9集团参加了上海光源的设计、建设和治理 ，这是一个用于大分子晶体学的工业光束线站 ，大分子光束线于2009年7月开明。
工业用大分子晶体学线站卓越的光束线和服务 更低的成本 3.5 GeV存储环 整年运营紧邻张江高科技园区和浦东机场 - 钻研案例KRAS-G12D
KRASG12D的筛选
KRASG12D的X射线衍射数据KRAS-G12D with MRTX1133
共晶的筛选
共晶的X射线衍射数据KRAS-G12D
KRASG12D与7RPZ的结构比力 ，绿色为PDB ID 7RPZ ，粉色为J9集团的数据。这些数据关联性极度强。KRAS-G12D with MRTX1133
KRASG12D与MRTX1133的共结晶结构(7RPZ, PDB)比力 ，绿色结构为PDB ID 7RPZ ，青色为J9集团的数据。这些数据关联性极度强。KRAS-G12D with MRTX1133
与GDP结合的KRASG12D与MRTX1133的共晶结构
KRAS靶向药物的体表钻研- 在钻研和开发的初始阶段 ，体表职能分析对候选KRAS靶向药物的现实评估至关沉要。这些分析为验证KRAS靶向药物活性提供了科学凭据 ，并提供了支持医治成效的初步证据。因而 ，它们在KRAS靶向候选药物选择的决策过程中起着关键作用。KRAS细胞试验J9集团已经验证了KRAS突变细胞系的细胞毒性测试步骤 ，2D和3D试验均可用于KRAS抑造剂的评估。
通过CellTiter-Glo检测2D细胞增殖试验
- 细胞毒性试验(3D)NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity Assay (3D)
以1 μM肇始浓度、按1:3陆续稀释的药物处置NCl-H358细胞288 h后 ，显微镜检测细胞毒性了局。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (2D; 3 days)
以1 μM肇始浓度、1:3陆续稀释的药物处置NCI-H358细胞72 h后 ，CTG测定细胞毒性。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (3D;12 days)
以1 μM肇始浓度、1:3陆续稀释的药物处置NCI-H358细胞288 h后 ，显微镜测定细胞毒性。
- 基于蛋白的生化活性试验
Kras G12C-SOS1结合的IC50活性测试筛选试验化合物
- 鸟嘌呤核苷酸互换试验
KRAS在含有1mM BODIPY FL-GDP, 20 mM HEPES pH 7.6, 10 mM EDTA, 20 mM硫酸铵和1 mM DTT的溶液中 ，在4°C下孵育48幼时。用20 mM MgCl2溶液终场反映。将含有KRAS蛋白的BODIPY-FL-GDP浓缩去除BODIPY-FL-GDP。图A：试验步骤的MoA
KRAS靶向药物的药理药效学钻研- KRAS突变-CDX模型
Cancer Type Cell Lines KRAS G12C MIA PaCa-2, NCI-H358, UM-UC-3, Calu-1 KRAS G12D GP2D, SW1990, AsPC-1 KRAS G12V SW480, CAPAN-1, NCI-H727 KRAS G13D LoVo, HCT-116, HT15 Medicilon Case: CDX - KRAS Mutation (G12C)
PDX沉要突变/过表白/耐药模型GENE PDX ID KRAS Mutation PDXM-060C (p.G12V), PDXM-069C (p.G12V),PDXM-075C (p.G12D), PDXM-076C (p.G13D),PDXM-212Li (p.G12D) TP53 Mutation PDXM-060C (p.R273H), PDXM-072C(p.Y234H) PIK3CA Mutation PDXM-075C (p.H1047L), PDXM-092Ga (p.E545G) BCR-ABL Fusion PDXM-242Le ERBB2 Overexpression PDXM-069C, PDXM-016C, PDXM-060C, PDXM-087C, PDXM-104C… ... ... Resistance* PDX ID Docetaxel + Cisplatin PDXM-271O (Ovarian cancer) VDLP + MA + CVAD PDXM-293Le (Leukemia) Radiation PDXM-311(H&N) ... ... * Note: these resistance models are not related to KRAS mutation
- Medicilon Case: PDX -- KRAS Mutation (G12D)
Medicilon Case: AMG-510 Resistant Model - Calu-1 (G12C)
野生型肺癌模型
耐药肺癌模型(通过体内医治2个周期(P2)成立 ，每个周期2个月。这里展示的是P3了局。
KRAS靶向药物的药代动力学钻研- J9集团为KRAS靶向药物PK钻研的关键参数提供高质量的定量分析 ，了局正确。J9集团案例：KRAS-PDEδ抑造剂的药代动力学KRAS-PDEδ蛋白-蛋白相互作用是癌症医治的一个极具吸引力的靶点。设计并合成了一系列高效的PROTAC PDEδ降解剂。最有潜力的Compound 17f是医治KRAS突变型结直肠癌的PROTAC PDEδ降解剂。Compound 17f为KRAS-PDEδ相互作用的可成药性钻研提供了新的化学工具或先导化合物。Compound 17f在SW480结直肠癌异种移植模型中拥有显著的抑造肿瘤成长作用。这项验证钻研为靶向KRAS-PDEδ相互作用的可成药性提供了新的战术 ，并为医治KRAS突变型癌症提供了有效的先导化合物。
PROTAC战术和KRAS-PDEδ抑造剂Compound 17f[3]
- 选取Sprague-Dawley (SD)大鼠进行Compound 17f的药代动力学钻研。在剂量为50 mg/kg下腹腔注射给药后 ，分析Compound 17f在血浆中的浓度。这些试验由J9集团进行。Compound 17f的半衰期约为5.1 h ，峰值浓度Cmax为564 ng/mL。固然Compound 17f的分子量较大(MW=723) ，但能在大鼠体内有效吸收并达到足够的血浆露出量 ，其曲线下面积(AUC)值为4710 h·ng/mL。
Compound 17f在大鼠体内的PK参数[3]
J9集团助力KRAS项目举例- 2022年5月 ，NMPA核准了信诺维抗肿瘤1类新药XNW14010的临床申请 ，拟用于医治伴有KRAS G12C突变的晚期实体瘤。XNW14010是一种高选择性的幼分子KRASG12C蛋白共价结合抑造剂。临床前尝试数据显示XNW14010在分歧的肿瘤模型中均有优良的抗肿瘤活性 ，且出现优良的量效关系 ，并拥有优良的经口给药药代动力学特点和较为梦想的安全窗口。J9集团作为信诺维的合作同伴 ，为XNW14010的研发提供了（蕴含药代动力学和安全性评价在内）综合性临床前钻研服务 ，为项目获批临床提供了有力支持。
- 2024年9月 ，劲方医药KRAS G12C抑造剂达伯特?（氟泽雷塞片 ，GFH925/IBI351）上市。本品单药疗法合用于至少接受过一种系统性医治的KRAS G12C突变型晚期非幼细胞肺癌（NSCLC）成人患者。这是国内首个获批的 KRAS G12C抑造剂 ，也是全球第三个上市的KRAS G12C抑造剂。J9集团依附成熟的药代动力学钻研平台 ，为氟泽雷塞提供了早期阶段的动物尝试药物代谢动力学服务 ，以研发过程的高效与精准 ，助力氟泽雷塞的早期开发。
- 参考文件：
[1] Pingyu Liu, et al. Targeting the untargetable KRAS in cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 2019 Sep;9(5):871-879. doi: 10.1016/j.apsb.2019.03.002.
[2] Tatu Pantsar. The current understanding of KRAS protein structure and dynamics. Comput Struct Biotechnol J. 2019 Dec 26:18:189-198. doi: 10.1016/j.csbj.2019.12.004.
[3]Junfei Cheng, et al. Discovery of Novel PDEδ Degraders for the Treatment of KRAS Mutant Colorectal Cancer. J Med Chem. 2020 Jul 23;63 (14):7892-7905. doi: 10.1021/acs.jmedchem.0c00929.
[4]Gongmin Zhu, et al. Role of oncogenic KRAS in the prognosis, diagnosis and treatment of colorectal cancer. Mol Cancer. 2021 Nov 6;20(1):143. doi: 10.1186/s12943-021-01441-4.
[5]Tamas Yelland, et al. Stabilization of the RAS:PDE6D Complex Is a Novel Strategy to Inhibit RAS Signaling. J Med Chem. 2022 Feb 10;65 (3):1898-1914. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c01265.
[6]Timothy H Tran, et al. KRAS interaction with RAF1 RAS-binding domain and cysteine-rich domain provides insights into RAS-mediated RAF activa-tion. Nat Commun. 2021 Feb 19;12(1):1176. doi: 10.1038/s41467-021-21422-x.
